方法原理

第二法外标法包含三种前处理方式：水解-提取法、乙酰氯-甲醇法和酯交换法。试样经前处理后生成脂肪酸甲酯，经毛细管柱气相色谱分析，外标法定量测定脂肪酸的含量。

• 水解-提取法：试样经水解、乙醚溶液提取其中的脂肪后，在碱性条件下皂化和甲酯化，生成脂肪酸甲酯，经毛细管柱气相色谱分析，外标法定量。动植物纯油脂试样不经脂肪提取，直接进行皂化和脂肪酸甲酯化。

• 乙酰氯-甲醇法：适用于含水量小于5%的乳粉和无水奶油试样。乙酰氯与甲醇反应得到的盐酸-甲醇使其中的脂肪和游离脂肪酸甲酯化，用甲苯提取后，经气相色谱仪分离检测，外标法定量。

• 酯交换法：适用于游离脂肪酸含量不大于2%的油脂。将油脂溶解在异辛烷中，加入氢氧化钾甲醇溶液通过酯交换甲酯化，反应完全后，用硫酸氢钠中和剩余氢氧化钾，外标法定量。

试剂与材料

除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为三级水。

• 脂肪酸甘油三酯标准品：用于外标法定量

• 乙醚

• 石油醚：沸程30℃～60℃

• 乙醇：95%

• 氢氧化钾

• 甲醇

• 三氟化硼：14%甲醇溶液

• 乙酰氯

• 甲苯

• 正己烷：色谱纯

• 异辛烷

• 无水硫酸钠

• 碳酸钠

• 硫酸氢钠

• 氢氧化钾-甲醇溶液（0.5 mol/L）：称取氢氧化钾2.8 g，溶于100 mL甲醇中

• 乙酰氯-甲醇溶液（10%）：量取40 mL甲醇于100 mL干燥烧杯中，准确吸取5.0 mL乙酰氯缓慢加入，不断搅拌，冷却后转移并定容至50 mL干燥容量瓶中

• 碳酸钠溶液（6%）

• 饱和氯化钠溶液

仪器与设备

• 气相色谱仪：配氢火焰离子化检测器（FID）

• 毛细管色谱柱：极性柱，如SP-2560或等效柱（100 m × 0.25 mm × 0.20 μm）

• 分析天平：感量0.1 mg

• 恒温水浴锅

• 具塞比色管：50 mL

• 分液漏斗：250 mL

• 离心管：50 mL

• 旋转蒸发仪

• 离心机

分析步骤

一、水解-提取法

1. 试样制备

称取均匀试样适量（固体试样0.5～5 g，精确至0.1 mg；液体试样5～10 g）于50 mL具塞比色管中，加入2 mL 95%乙醇和4 mL水，混匀。

2. 水解

加入10 mL盐酸溶液（1+1），混匀。将比色管放入70～80℃水浴中水解40 min。水解过程中每隔10 min振摇一次。水解完成后取出，冷却至室温。

3. 脂肪提取

加入10 mL 95%乙醇，混匀。加入30 mL乙醚-石油醚混合液（乙醚:石油醚 = 1:1），加盖振摇5 min，静置10 min。将醚层提取液收集至250 mL烧瓶中。按上述步骤重复提取3次，合并醚层提取液。

4. 浓缩

将合并的醚层提取液于旋转蒸发仪上蒸干（水浴温度40～50℃），残留物即为脂肪提取物。

5. 皂化与甲酯化

向烧瓶中加入4 mL 0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液，于45℃水浴中加热20 min进行皂化。将皂化液移入20 mL比色管中，加入4 mL 14%三氟化硼甲醇溶液，于45℃水浴中加热20 min进行甲酯化。

6. 萃取

冷却至室温后，加入3 mL正己烷，振摇萃取2 min，静置分层。取正己烷层（上层），加入少量无水硫酸钠脱水，经0.22 μm滤膜过滤后供气相色谱分析。

二、乙酰氯-甲醇法（适用于含水量小于5%的乳粉和无水奶油）

1. 试样制备

称取乳粉或无水平奶油试样约0.1～0.5 g（精确至0.1 mg）于50 mL具塞玻璃管中。

2. 甲酯化

加入10%乙酰氯-甲醇溶液6.0 mL，充氮气后旋紧螺旋盖，振荡混合。于80℃±1℃水浴中放置2 h，期间每隔20 min取出振摇一次。水浴后取出冷却至室温。

3. 提取与中和

将反应后的样液转移至50 mL离心管中，分别用3.0 mL 6%碳酸钠溶液清洗玻璃管三次，合并碳酸钠溶液于50 mL离心管中，混匀。5000 r/min离心约5 min。取上清液（有机相），经0.22 μm滤膜过滤后供气相色谱分析。

三、酯交换法（适用于游离脂肪酸含量不大于2%的油脂）

1. 试样制备

称取油脂试样约0.1 g（精确至1 mg）于15 mL离心管中。

2. 溶解与酯交换

加入异辛烷2 mL溶解试样。加入0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液1 mL，涡旋混匀1 min，室温下反应至溶液澄清。

3. 中和

加入硫酸氢钠约0.2 g，涡旋混匀，中和剩余的氢氧化钾，以避免甲酯皂化。

4. 萃取

加入饱和氯化钠溶液2 mL，振摇，静置分层。取有机层（上层），加入少量无水硫酸钠脱水，经0.22 μm滤膜过滤后供气相色谱分析。

四、标准溶液制备与外标法定量

关键要求：外标法必须使用相应的脂肪酸甘油三酯作为定量外标。脂肪酸甘油三酯标准溶液须经过酯交换转变为脂肪酸甲酯后方可上机检测，不可直接将脂肪酸甘油三酯上机检测，也不可使用脂肪酸甲酯作为外标进行定量计算。

标准溶液配制：

称取适量的脂肪酸甘油三酯标准品，用异辛烷溶解并稀释，配制成适当浓度的标准溶液。标准溶液按照与试样相同的酯交换步骤进行甲酯化处理，得到脂肪酸甲酯标准使用液。

标准曲线制作：

将脂肪酸甲酯标准使用液配制成至少5个浓度梯度的标准系列，按选定的色谱条件分别进样分析。以脂肪酸甲酯的峰面积为纵坐标，对应的脂肪酸甘油三酯浓度为横坐标，绘制标准曲线。

色谱条件（参考）：

• 载气：氮气或氦气，纯度≥99.999%，恒流模式

• 进样口温度：250℃

• 检测器温度：250℃

• 分流比：根据浓度调整，通常为30:1

• 进样量：1.0 μL

• 升温程序：初始温度100℃，保持2 min；以5℃/min升至240℃，保持10 min

五、样品测定

按上述色谱条件，取试样处理液和标准使用液分别进样分析，记录各脂肪酸甲酯的保留时间和峰面积。以标准品的保留时间与试样色谱峰对照进行定性。根据标准曲线，由试样中各脂肪酸甲酯的峰面积计算对应的脂肪酸含量。

结果计算

外标法直接计算样品中脂肪酸的含量，不需要计算脂肪酸甲酯的含量。

Xi = (Ai × mSi × FTG-FAi) / (ASi × m)

式中：

• Xi —— 试样中某脂肪酸的含量，mg/g；

• Ai —— 试样中某脂肪酸甲酯的峰面积；

• ASi —— 标准溶液中对应脂肪酸甲酯的峰面积；

• mSi —— 标准溶液中脂肪酸甘油三酯的质量，mg；

• m —— 试样质量，g；

• FTG-FAi —— 脂肪酸甘油三酯转化为相应脂肪酸的转换系数。

结果保留3位有效数字。

关键注意事项

• 标准品选择：外标法使用脂肪酸甘油三酯作为标准品，不可使用脂肪酸甲酯作为外标进行定量计算。脂肪酸甘油三酯标准溶液浓度的选择可根据实际样品中脂肪酸的含量进行优化调整，使其尽量接近样品中含量。

• 标准溶液处理：脂肪酸甘油三酯标准溶液必须经过酯交换转变为脂肪酸甲酯后方可上机检测，不可直接将脂肪酸甘油三酯上机检测。

• 水解温度与时间：水解-提取法中70～80℃水解40 min，须严格控制，水解不完全会导致脂肪酸释放不充分。

• 乙酰氯-甲醇法条件：10%乙酰氯-甲醇溶液6.0 mL，80℃±1℃水浴2 h，期间每隔20 min振摇。该法可在同一个水解管中完成水解、释放、甲酯化及萃取，操作简便。

• 甲酯化温度控制：三氟化硼-甲醇法须在45℃水浴中反应20 min，温度过高或时间过长可能导致不饱和脂肪酸的异构化。

• 碳酸钠溶液清洗：乙酰氯-甲醇法中须用碳酸钠溶液清洗玻璃管三次并合并，以充分转移甲酯化产物并中和余酸。

• 色谱柱选择：须使用极性毛细管柱（如SP-2560、CD-2560等），以保证各脂肪酸甲酯的有效分离。若出峰数不足，可通过微调流速（0.8～1.0 mL/min）优化分离度。

• 定性确认：标准品与试样的色谱峰保留时间应一致，必要时可采用加标法确认。